Staphylococcus aureus (S. aureus) adalah bakteri patogen opurtunis pada manusia dan pada sapi perah. S. aureus adalah penyebab utama intramammae infeksi, yang menular pada sapi perah, yang merupakan alasan utama penggunaan antibiotik di peternakan sapi perah. Meskipun, S. aureus telah berhasil diisolasi dari tubuh sapi serta dari lingkungan peternakan sapi perah, ambing adalah sumber utama S. aureus penyebab mastitis. S. aureus pada sapi perah dan lingkungannya patut diperhatikan tidak hanya karena dapat menyebabkan mastitis, tetapi juga karena potensi bakteri ini menjadi pengkontaminasi dalam susu dan mudah dipindahkannya bakteri melalui pekerja perantara, air dan peralatan produksi.
Upaya untuk mengendalikan infeksi intramammae telah banyak dilakukan. Namun, hingga saat ini kendala yang muncul adalah kesulitan dalam memberantas infeksi intramammae yang disebabkan bakteri patogen ini dan masih menyebabkan masalah ekonomi yang substansial. Penggunaan antimikroba dalam sistem produksi industri peternakan sapi perah dan juga di industri peternakan lainnya adalah fokus utama fenomena munculnya resistensi pada bakteri patogen zoonosis. Meskipun ada perbedaan kelas antibiotik yang digunakan pada hewan dan manusia, seleksi resistensi terhadap satu kelas antibiotik berpotensi menimbulkan resistensi silang terhadap antibiotik lain kelas antibiotik.
Studi tentang profil sensitivitas antibiotik pada sapi susu telah dilakukan, tapi informasi di profil kepekaan terhadap antibiotik di Indonesia, khususnya di Jawa Timur, masih sangat terbatas. Penelitian ini bertujuan mengetahui profil sensitivitas antibiotik S. aureus yang diisolasi dari susu sapi di Jawa Timur dari beberapa peternakan sapi perah di beberapa
daerah di Jawa Timur. Yaitu, Kota Batu, Kabupaten Pasuruan, dan Kabupaten Lumajang.
Informasi dan data yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan gambaran tentang profil sensitivitas antibiotik dari susu sapi. Termasuk mengetahui prevalensi penyandi gen enterotoksin C di Jawa Timur sehingga dapat bermanfaat sebagai bahan informasi untuk tindakan pengendalian terhadap S. aureus yang resisten hingga penggunaan antibiotik pada sapi perah.
Pengambilan sampel swab pada mukosa hidung anjing dilakukan dengan kapas kemudian disaring secara bertahap pada media Mannitol Salt Agar (MSA), kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Koloni yang tumbuh pada agar Mannitol Salt, kemudian diperiksa secara mikroskopis. Uji biokimia bakteri Staphylococcus aureus menggunakan uji katalase, uji koagulase, uji Voges Proskauer (VP) dan uji hemolisis.
Bakteri yang diisolasi diidentifikasi, sebagian kecil usus besar diambil dengan jarum loop, kemudian ditanam di Mueller Hinton Broth, diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam setelah itu terlihat pertumbuhan bakteri dan dibandingkan suspensi turbiditas suspensi bakteri sebesar 1,5×108 per milimeter sesuai ke standar Mac Farland 0.5. Uji sensitivitas antibiotik menggunakan metode difusi untuk Kirby Bauer. Usapkan secara merata ke seluruh permukaan MHA lalu biarkan cawan petri selama 5 menit. Antibiotik ditempatkan pada permukaan agar-agar dengan sedikit tekanan menggunakan penjepit steril agar piringan terpasang sempurna pada permukaan agar-agar.
Inkubasi media pada suhu 370C selama 18-24 jam. Hasil uji difusi cakram menunjukkan zona bening atau bening di sekitar kertas cakram sebagai area penghambat pertumbuhan bakteri. Area hambatan kemudian diukur menggunakan batang. Besarnya diameter daerah hambat digunakan untuk mengetahui kepekaan bakteri terhadap antibiotik yang dikelompokkan menjadi dua kategori yaitu sensitif (P), sedang (I) dan resisten (R).
Ekstraksi DNA menggunakan kit jaringan Qiamp (QIAGEN, Hilden Germany). Reagen PCR terdiri dari 12,5 µl 2x master mix (intron), 1 µl spa primer (sense) dan 1 µl primer (antisense). Primer yang digunakan dalam penelitian ini adalah primer menurut Akineden et al. 2001. spa-f: 5′- CAA GCA CCA AAA GAG GAA-3 ‘dan spa-r: 3′-CAC CAG GTT TAA CGA CAT-5’ dengan primer ini dalam studi Akineden, 2001 Ini dapat dibaca panjang lebar 110 , 140, 170, 190, 220, 240, 270, 290 dan 320 bp. 0,5 µl akuades dan 5 µl cetakan DNA ke dalam tabung eppendorf 0,2 ml.
Campuran dimasukkan ke dalam mesin PCR dan memasuki tahap denaturasi awal 94 oC 30 detik, denaturasi 94 oC, anil 60oC dan ekstensi 72oC selama 1 menit dengan siklus 30 kali dan ekstensi akhir 72oC selama 30 detik. Tahap terakhir, hasil PCR dideteksi dengan elektroforesis. Sebanyak 5 µl produk PCR dari DNA Staphylococcus aureus dimasukkan ke dalam gel agarose 2% yang mengandung 2 µl redsafe dalam 20 ml TBE 1x untuk proses running. Setelah 30 menit, hasil dapat divisualisasikan melalui sinar ultraviolet dengan transluminator UV.
Berdasarkan analisis terhadap 45 sampel usap mukosa hidung anjing, diperoleh 5 koloni bakteri positif yang memfermentasi manitol pada media Mannitol Salt Agar dan berbentuk kokus, bergerombol dan Gram positif pada pemeriksaan mikroskopis. Hasil identifikasi dengan uji katalase, koagulase, uji Voges Proskauer (VP) dan uji hemolisis diperoleh koloni dengan sifat-sifat penghasil enzim katalase dan koagulase, menghasilkan asetil-metil-karbinol dan pembentukan β-hemolisis pada media Agar Darah. Hasil penelitian menunjukkan bahwa koloni bakteri positif Staphylococcus aureus berjumlah 5 dari 45 usapan mukosa atau sekitar 11%. Dari 45 uji identifikasi sampel didapatkan 5 isolat yang positif Staphylococcus aureus. Uji sensitivitas antibiotik pada isolat Staphylococcus aureus.
Hasil dalam penelitian ini adalah 3 dari 5 isolat Staphylococcus aureus positif MRSA dan 2 isolat Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus (MSSA). MRSA tidak hanya penting dalam aspek kesehatan hewan, karena bakteri ini merupakan salah satu bakteri zoonosis. Hasil identifikasi gen spa dengan teknik PCR menggunakan primer spesifik mengacu pada penelitian Akineden menyatakan bahwa perbedaan panjang gen spa pada isolat Staphylococcus aureus yang memiliki tiga pita yaitu 220 bp, 290 bp dan 600 bp.
Hasil penelitian strain MRSA dan MSSA dapat ditemukan adanya pita ganda dari hasil PCR. Keberadaan produk pita doubel dijelaskan dengan adanya lebih dari satu alel pada gen coa dengan produk gen 600, 680 dan 850 bp. Faktor virulensi dalam patogenesis Staphylococcus aureus meliputi faktor permukaan sel, faktor yang disekresikan. Faktor permukaan sel termasuk komponen permukaan mikroba yang mengenali molekul matriks perekat (MSCRAMMs), polisakarida kapsular dan Staphyloxanthin. Komponen permukaan mikroba mengenali molekul matriks perekat (MSCRAMM) termasuk Staphylococcal protein A (SpA), protein pengikat Fibronektin (FnbpA dan FnbpB), protein pengikat kolagen dan protein faktor penggumpalan (ClfA dan ClfB). Staphylococcal protein A (SpA) mengikat IgG dan membantu proses opsonisasi dan fagositosis. Protein pengikat fibronektin (FnbpA dan FnbpB) untuk menempelkan fibronektin dan bekuan plasma. Protein pengikat kolagen membantu jaringan kolagen dan tulang rawan. Protein faktor penggumpal (ClfA dan ClfB) untuk membantu pembekuan dan fibrinogen.
Pendeteksian Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) dapat dilakukan dengan menggunakan gen spa yang mengkode protein A. Data epidemiologi menunjukkan bahwa penyebaran MRSA merupakan salah satu objek utama. Studi menemukan bahwa mengetik menggunakan gen spa mampu mengidentifikasi 27 dari 29 strain. Gen spa terbukti berfungsi sebagai pendeteksian molekul yang sebanding dengan Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE).
Gen yang menyandi protein A (spa) merupakan marker yang paling banyak digunakan untuk pendeteksian molekuler karena mengandung unit polimorfik. Gen pengkode protein A juga merupakan pilihan yang baik untuk dapat mengidentifikasi dan membedakan variabilitas strain Staphylococcus aureus. Protein A yang dikodekan oleh gen spa terdiri dari beberapa daerah. Area pengikatan Fc terdiri dari lima ulangan 160 bp. Gen yang menyandikan protein A termasuk daerah Xr polimorfik dari sejumlah variabel.
Gen wilayah Spa-X merupakan gen yang selalu ditemukan pada semua strain S. aureus dan menunjukkan variasi pengulangan tandem sekitar 24 bp dalam jumlah yang bervariasi (2-16 kali) di wilayah konservasi genom S. aureus. Adanya delesi dan pengulangan tandem pada gen spa mengakibatkan munculnya sifat polimorfisme gen spa yang ternyata dapat mempengaruhi patogenisitas S. aureus. Tingginya jumlah pengulangan tandem pada gen spa mampu meningkatkan patogenisitas S. aureus dan terlihat pada strain S. aureus penyebab kasus epidemik.
Penelitian tentang sifat polimorfisme gen S. aureus spa juga telah banyak dilakukan di dunia. Sifat polimorfisme gen spa dan gen coa dari isolat S. aureus asal manusia menunjukkan bahwa terdapat lima jenis ukuran pita yang berbeda untuk gen spa dan enam jenis ukuran pita yang berbeda untuk gen coa melalui PCR. Adanya polimorfisme gen spa isolat S. aureus dari abses pada domba dan menunjukkan adanya dua jenis ukuran pita yang berbeda pada uji PCR yaitu 100 bp dan 300 bp. Kedua penelitian ini hanya menunjukkan polimorfisme gen spa yang terjadi melalui PCR, tanpa disertai analisis pengulangan tandem untuk sekuens gen spa. Polimorfisme gen S. aureus spa yang berasal dari kasus mastitis kambing sambil menganalisis gen spa berulang tandem menggunakan dua metode, PCR dan pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Penelitian ini menghasilkan 19 jenis gen spa dari 47 isolat S. aureus melalui uji PFGE. Polimorfisme wilayah X banyak digunakan sebagai dasar untuk metode genotipe, kekuatan diskriminatif yang memungkinkan pengenalan perbedaan kecil antara strain terkait genetik dan memungkinkan penyelidikan epidemiologi yang efektif.
Berdasarkan hasil penelitian isolat Staphylococcus aureus dapat ditemukan usap mukosa hidung anjing sebesar 11%. Dari empat puluh lima sampel usap mukosa hidung anjing, ditemukan lima isolat Staphylococcus aureus. Terdapat keragaman amplikon pada gen spa pada hasil PCR pada Staphylococcus aureus yang berasal dari strain MRSA dan strain MSSA dari mukosa hidung anjing. Hasil PCR untuk lima isolat yaitu tiga pita 220 bp, 290 bp dan 600 bp, dan ditemukan bahwa isolat yang memiliki pita ganda menunjukkan lebih dari satu alel pada gen spa. Gen spa dapat menjadi indikator penentuan strain Staphylococcus aureus sebagai penanda untuk dicari pendekatan epidemiologi molekuler. (*)
Penulis korespodensi : Dr. Mustofa Helmi Effendi, drh., DTAPH.
Harijani, N., Ayu Wandari, Mustofa Helmi Effendi and Wiwiek Tyasningsih. 2020. Molecular Detection of Encoding Enterotoxin C Gene and Profile of Antibiotic Resistant On Staphylococcus Aureus Isolated From Several Dairy Farms In East Java, Indonesia. Biochem. Cell. Arch. 20 (1): 3081-3085.
