Salah satu metode paling ekonomis untuk memproduksi berbagai protein rekombinan bernilai tinggi, contohnya enzim yang digunakan dalam industri pangan, farmasi, dan bioenergi, serta protein terapetik yang berkhasiat medis, adalah menggunakan bakteri Escherichia coli sebagai inang ekspresi. E. coli mampu mengekspresikan protein rekombinan secara cepat (24-48 jam) dalam kuantitas tinggi dengan menggunakan media tumbuh yang relatif murah, contohnya molase (limbah gula).
Namun, laju produksi yang cepat tersebut menyebabkan protein rekombinan tidak secara maksimal dapat ‘dilipat’ ke konfigurasi aslinya sehingga hanya sebagian kecil dari total protein yang dihasilkan terlarut dan fungsional, sehingga dibutuhkan langkah-langkah tambahan seperti pelarutan dan pelipatan kembali yang membutuhkan biaya tinggi dan memakan waktu lama.
Sel bakteri memiliki mekanisme pelipatan protein (protein folding) yang memfasilitasi pembentukan protein aktif yang dinamakan molecular chaperone system. Laju produksi protein yang tinggi akan menyebabkan kegagalan sebagian besar protein rekombinan berinteraksi dengan sistem molecular chaperone sehingga sebagian protein akan dihasilkan tidak terlarut dan non-aktif.
Dalam penelitian yang dilakukan bersama tim dari Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) ini, dibangun suatu sistem biologi sintetik di mana molecular chaperone dapat berinteraksi langsung dengan protein rekombinan tepat setelah atau selama protein rekombinan disintesis melalui proses translasi, menjamin terbentuk protein rekombinan yang terlarut dan aktif.
Sistem yang pertama adalah Chaperone-recruiting mRNA scaffold (CRAS) di mana molecular chaperone “ditempelkan” ke mRNA dari protein target sehingga proses pelipatan protein dapat berlangsung segera setelah protein selesai ditranslasikan (Gambar 1). Penempelan molecular chaperone pada CRAS system difasilitasi oleh suatu RNA binding protein yang akan mengikat suatu struktur loop spesifik di ujung 3’ dari mRNA protein target. Molecular chaperone yang dipilih dalam sistem ini adalah DnaJ, elemen penting dari sistem DnaJK-GrpE yang berperan dalam pelipatan lebih dari 70 persen protein di Escherichia coli.
Dengan sistem CRAS, 70-90 persen dari total protein target rekombinan diekspresikan dalam wujud terlarut dan fungsional di E. coli. Di antara protein-protein tersebut adalah anti-Ras ScFv yang merupakan agen terapi anti kanker potensial dan Alcohol dehydrogenase I dari ragi Saccharomyces cerevisiae yang dapat digunakan dalam sintesis obat anti-kanker, anti-hipertensi, antibiotik, dan biofuel.
Sistem Chaperone-substrate co-localized expression (CLEX)
Sedangkan pada sistem kedua, yaitu sistem Chaperone-substrate co-localized expression (CLEX), chaperone DnaJ diekspresikan secara simultan dengan protein target dalam satu mRNA dan dipisahkan dengan stop codon dan start codon yang saling tumpoang tindih (5’-TAATG-3’), sehingga proses pelipatan protein dapat terjadi secara bersamaan dengan proses translasi (Gambar 1). Mekanisme kerja tersebut membuat sistem CLEX efektif untuk lebih banyak protein target dibandingkan sistem CRAS. Sistem CLEX mampu mencegah protein terlipat secara salah selama proses translasi, tanpa harus menunggu proses translasi selesai seperti dalam mekanisme sistem CRAS.
Dengan sistem ini protein target dengan ukuran di bawah 40kDa, yang sebelumnya tidak dapat ditingkatkan kelarutannya dengan sistem CRAS, mampu diproduksi dalam bentuk terlarut dan fungsional. Protein-protein tersebut antara lain adalah leptin, protein terapetik yang digunakan dalam terapi diabetes dan obesitas, Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2), protein terapetik yang digunakan dalam terapi gigi dan tulang, dan HIV-1 protease, suatu protein yang digunakan dalam riset pengembangan antivirus HIV.
Namun, sistem ini masih belum berhasil digunakan untuk meningkatkan kelarutan dari protein target yang berukuran lebih dari 40 KDa contohnya lipase tahan suhu tinggi dari Pseudomonas fluorescens (52 KDa). Hanya jika lipase tersebut dibagi menjadi dua fragmen dengan ukuran masing-masing di bawah 40 KDa, keduanya dapat dihasilkan dalam bentuk terlarut dengan sistem CLEX.
Kedua sistem berbasis biologi sintesis yaitu CRAS dan CLEX terbukti mampu meningkatkan produksi protein rekombinan terlarut dan fungsional di E. coli. Dalam skala industri, penggunaan sistem berbasis chaperone seperti sistem CRAS dan CLEX memiliki kelebihan berupa efisiensi energi dan waktu, dibandingkan pendekatan lain untuk meningkatkan kelarutan dan fungsionalitas protein. Misalnya, penggunaan suhu rendah dan penggunaan senyawa induktor dalam konsentrasi rendah. Namun, kedua sistem tersebut masih membutukan penyempurnaan dan optimasi, seperti penambahan jenis chaperone dan optimasi tingkat ekspresi chaperone, karena aplikasinya saat ini masih terbatas untuk protein target dengan ukuran molekul di bawah 40 KDa. (*)
Penulis: Almando Geraldi
Informasi yang lebih mendetail dari tulisan ini dapat dilihat di:https://www.mdpi.com/1422-0067/20/13/3163/htm
