Tuberkulosis paru merupakan penyakit infeksi menular, disebabkan bakteri Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC). Tuberkulosis paru masih merupakan masalah Kesehatan utama penyebab kematian di dunia. Bakteri ini merupakan suatu patogen intraseluler, membangkitkan mekanisme dalam sel Fagosom, interaksi antara bakteri pathogen dengan hospes, reaksi sangat tergantung sekresi protein efektor yang tertanam pada dinding sel bakteri dan berupa kompleks multiprotein yang membentuk suatu apparatus sekretori.
Bakteri MTBC memiliki variasi mekanisme untuk bertahan hidup dalam komponen sel Fagosom.Sistem ESX-1, diantaranya system sekretori tipe VII (T7SS), termasuk protein early secreted antigenic target (ESAT-6, berat molekul 6-kDa), dan protein culture filtrate protein CFP-10, sekresi melalui envelope dinding sel bakteri. Genoma MTBC mengandung lima gen ESX paralog, ESX-1dan ESX-5 berperan pada virulensi, ESX-1 terdiri dari 20 gen penyandi berlokasi pada core region mencakup mulai dari espE (rv 3864) sampai mycP1 (rv 3883c). Elemen trans-acting di luar core region ada 4 gen dinamakan extended ESX-1 contohnya espR (rv 3849) dan espA, C, D (rv 3616 sampai rv 3614c). Demikian juga ESAT-6 (esxA, rv 3875) dan CFP-10 (esxB, rv 3874) termasuk ESX-1, kedua gen ini membentuk heterodimer 1:1 dan tertanam translocated pada envelop dinding sel bakteri merupakan protein virulens yang meningkat pada TB paru aktif.
Indonesia ranking ketiga tertinggi di dunia, sebagai Negara terbeban TB paru. Pada tahun 2018 di Indonesia, total incidence rate kasus TB paru estimasi 316 kasus per 100.000 penduduk. Sampai saat ini dilaporkan peningkatan kasus resisten obat anti-TB (MDR/RR-TB).
Berdasar pentingnya mengatasi masalah pengendalian TB paru, diperlukan pengembangan metode deteksi MTBC akurat dan cepat. Sampai saat ini, metode kultur masih merupakan gold standard diagnosis TB paru, namun ada kendala perlu waktu lama untuk memberikan hasil pemeriksaan. Demikian juga metode mikroskopis ada masalah rendahnya sensitifitas dan spesifisitas, diperlukan metode akurat dan cepat seperti polymerase chain reaction (PCR) sebagai komplementer test pada metode kultur dan mikroskopis. Penegakan diagnosis TB paru penting pada pengendalian TB dan mencegah mortalitas pada TB paru aktif.
Salah satu tahap pengembangan kit diagnostik PCR adalah penentuan suatu target gen spesifik MTBC. Gen espD merupakan bagian ESX-1 gene cluster.
Evidens menyatakan gen espD dapat menstabilkan espA dan espC di tingkat seluler, sekresi espA dan espC, berperan pada regulasi sekresi protein virulens ESAT-6, CFP-10, dan protein virulens lainnya yang berkaitan dengan kerusakan jaringan paru. Karakteristik unik pada espD berpotensi sebagai target spesifik biomarker untuk pengembangan diagnostik TB paru pada proses penyakit aktif. Deteksi dan identifikasi gen espD sebagai target pada diagnostik TB paru aktif, pada spesimen sputum dari pasien merupakan informasi penting pada identifikasi MTBC.
Studi ini bertujuan untuk evaluasi nilai metode PCR menggunakan target gen spesifik, gen espD MTBC, juga identifikasi epitope sel T yang penting perannya pada inflamasi pada TB paru proses penyakit aktif, serta prediksi struktur protein EspD yang berkaitan dengan regulasi sekresi protein yang berperan pada pathogenesis TB paru aktif.
Metode Penelitian
Sampel total 55 sputum dan 41 isolat kultur MTBC dari pasien TB paru baru dengan proses penyakit aktif, di RSUD Dr Soetomo Surabaya, pada bulan September 2016 sampai April 2019. Penyakit TB paru aktif dinyatakan berdasar hasil pemeriksaan klinik dan Foto rongen dada. Pada spesimen sputum dilakukan pemeriksaan GeneXpert MTB-RIF (Cepheid, Sunnyvale, CA) dan BD BACTECTM MGIT 960 system untuk konfirmasi identifikasi MTBC dan sensitivitas Rifampicin. Sampel Sputum dan isolat MTBC dilakukan pemeriksaan PCR target gen espD MTB, di Laboratorium Tuberkulosis ITD UNAIR. Penelitian ini disetujui Komite Etik RSUD DR Soetomo dengan sertifikat layak etik no. 541/Panke.KKE/IX/2016, 618/Panke.KKE/X/2017, dan 0410/KEPK/VII/2018. PCR menggunakan primer target gen 555 bp espD MTB M. tuberculosis H37Rv desain menggunakan Clone Manager software version 6.00. Positive Control reaksi PCR menggunakan M. tuberculosis H37Rv, M. fortuitum dan Staphylococcus aureus sebagai negative control. Hasil PCR dilakukan DNA sequencing di 1 st Base, Singapore, menggunakan ABI PRISM 3730xl Genetic Analyzer instrument (Applied Biosystems), analisis menggunakan BioEdit dan NCBI BLAST untuk menentukan prosentase homologi diantara sampel dengan M. tuberculosis H37Rv (NC_000962.3) GenBank, juga deteksi mutan atau varian gen. GENETYX untuk analisis epitope T-cell pada ekspresi gen espD. Struktur 3D pada espD dilakukan modelling menggunakan Structural homology modelling SWISS-MODEL server dan pendekatan prediksi struktur dan fungsi protein pada I-TASSER online server, dan visualisasi menggunakan program PyMOL Molecular Graphics System version 0.99, Schrödinger.
Hasil Penelitian
Pada 55 sampel sputum dapat dideteksi positif gen 555 bp espD 78 % (43/55), pada 41 isolat kultur MTBC 100% dideteksi gen espD. Pada semua sampel yang dilakukan DNA sequencing dinyatakan 100% identic terhadap sequens gen espD wild-type M. tuberculosis H37Rv (NC_000962.3). Prediksi epitope T-cell adalah VGSAAT, VSVSTL, LSARVA, ALLRKT berdasar pola posisi IAD, dan DLPG, DAVD, DPIIG, RVAW, DIAR, GLPS, EVFAT berdasar pola posisi Rothbard/Taylor. Prediksi struktur protein 3D pada EspD MTB ini dinyatakan suatu informasi baru. Model I-TASSER confidence score (C-score) -3.91, score tertinggi diantara beberapa model alternatif struktur protein EspD, estimasi RMSD 14.5 Å. Struktur mengandung suatu lipatan utama dari suatu three‑stranded antiparallel β‑sheet dan suatu long α‑helix dikelilingi oleh beberapa struktur sekunder minor.
Kesimpulan
Gen espD MTBC merupakan gen conserved, specific, dan stabil, dapat digunakan sebagai biomarker untuk penentuan penyakit TB paru aktif. Pada hasil penelitian dinyatakan informasi sekuens espD full gene, prediksi epitope, struktur protein 3D, pada strain MTB di Indonesia. Epitop T-cell penting berperan pada progresifitas inflamasi pada proses penyakit aktif pada TB paru. Struktur protein EspD berperan pada regulasi protein sekretori yang berperan pada pathogenesis TB paru. Temuan ini dapat mendasari pengembangan diagnostik dan pengobatan.
Penulis: Ni Made Mertaniasih
Informasi detail riset ini dapat dilihat pada tulisan kami di: https://www.ijmyco.org/article.asp?issn=2212-5531;year=2021;volume=10;issue=4;spage=421;epage=427;aulast=Mertaniasih
http://www.ijmyco.org on Saturday, January 8, 2022, IP: 245.48.68.198; doi: 10.4103/ijmy.ijmy_198_21;
Ni Made Mertaniasih, Desak Nyoman Surya Suameitria Dewi, Soedarsono Soedarsono, Anita Kurniati, Ali Rohman, Zakiyathun Nuha, Sohkichi Matsumoto. 2021; The espD Full Gene as a Potential Biomarker in Active Pulmonary Tuberculosis; International Journal of Mycobacteriology 2021: vol 10. Issue 4: 421 – 7.
