Dikutip dari WHO, Indonesia adalah salah satu negara tropis yang terkena dampak Virus Dengue (DENV). vektor-vektor dengue yang muncul memiliki empat serotipe yang berbeda secara antigenik. Empat serotipe virus dengue meliputi DENV-1, DENV-2, DENV-3 dan DENV-4. Virus dengue ditularkan oleh nyamuk Aedes aegypti dan Aedes albopictus. Penularan virus dengue melalui gigitan nyamuk betina Aedes yang terjadi ketika nyamuk menghisap darah orang yang terinfeksi virus dengue dan nyamuk tersebut menggigit orang lain. Gejala klinis meliputi Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) dan Dengue Shock Syndrome (DSS). Hal ini menyebabkan sekitar 100 juta kasus Demam Berdarah (DF), 500.000 kasus DHF serta 25.000 kematian dilaporkan setiap tahun di seluruh dunia. Oleh karena itu, diperlukan penelitian lebih lanjut tentang virus dengue.
Virus dengue merupakan virus RNA yang bisa diidentifiksi dengan metode Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dan Polymerase Chain Reaction (PCR). keberhasilan RT-PCR dan PCR ditentukan oleh proses ekstraksi RNA dengan pelarut presipitasi yang tepat, untuk mendapatkan RNA dengan kemurnian tinggi. Pelarut yang digunakan adalah Isopropanol, DMSO, Etanol 96%, Metanol, Asetone-Metanol (1:1), DMF, air destilasi. Pada penelitian ini, digunakan TRIzol sebagai metode ekstraksi RNA pada virus dengue DENV 1 Surabaya Genbank: AB915377.
Esktraksi RNA dengan metode TRIzol menggunakan reagen TRIZol yang terdiri dari larutan monofase fenol dan guanidium isosianat (Rio et al., 2010). Sampel DENV-1 dilarutkan dengan reagen TRIZol kemudian ditambahkan kloroform sehingga terjadi pemisahan fase. Fase organik mengandung protein, DNA berada di interface dan fase jernih mengandung RNA. Fasa jernih dipindahkan ke tube baru dan kemudian ditambahkan larutan presipitasi yaitu: isopropanol, DMSO, etanol 96%, metanol, aseton metanol (1:1), DMF, dan air destilasi. Dalam larutan, guanidium (NH2)2C=NH2+ dari reagen TRIzol menetralkan muatan negatif pada gugus PO43- dari asam nukleat dan menjadikan asam nukleat bersifat hidrofob dan kurang larut dalam air sehingga mengalami presipitasi.
Pelarut presispitasi yang memiliki konstanta dielektrik rendah memiliki kemampuan untuk mendukung interaksi antara ion guanidium dan fosfat sehingga asam nukleat menjadi kurang hidrofil dan mengendap. Kemurnian RNA ditentukan dengan mengukur absorbansi pada rasio 260/280 nm dengan spektrofotometer nanodrop. Pada penelitian ini absorbansi RNA dengan pelarut presipitasi isopropanol adalah 1,78, DMSO adalah 1,36, etanol 96% adalah 1,54, metanol adalah 1,01, aseton-metanol (1:1) adalah 1,81, DMF adalah 1,70, dan air destilasi adalah 1,40.
RNA murni memiliki nilai absorbansi sebesar 1.8 – 2.1 (Farrel., 2005). RNA murni didapatkan pada proses isolasi dengan pelarut presipitasi aseton-metanol (1:1) dengan nilai absorbansi sebesar 1,81. Isolat RNA yang telah didapat kemudian direverse transkripsi dengan RT-PCR untuk mendapatkan c-DNA (complementary DNA) dan selanjutnya diamplifikasi. c-DNA hasil amplifikasi kemudian dielektroforesis dengan gel agarosa dan divisualisasi dengan menggunakan Trans-illuminator UV.
Virus dengue dibawa oleh nyamuk betina dari spesies Aedes aegypti dan Aedes albopictus. RNA virus ini, dapat diidentifiksi dengan metode Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dan Polymerase Chain Reaction (PCR). Modifikasi metode isolasi RNA dari DENV-1 dengan metode TRIzol diharapkan dapat menghasilkan RNA yang berkualitas. Pengaruh pelarut presipitasi yang memiliki konstanta dielektrik rendah membuat asam nukleat menjadi kurang hidrofil dan mengendap. Kualitas RNA yang baik dapat dilihat dengan intensitas tinggi pita DNA yang dihasilkan dan intensitas noda yang rendah. Dari penelitian, RNA murni didapatkan pada proses isolasi dengan pelarut presipitasi aseton-metanol (1:1) dengan nilai absorbansi sebesar 1,81. Jadi, dari penelitian ini dilaporkan pelarut persipitasi aseton-metanol (1:1) merupakan pelarut presipitasi terbaik. (*)
Penulis: Teguh Hari Sucipto
Informasi detail tentang artikel ilmiah ini dapat dilihat di: https://e-journal.unair.ac.id/MKH/article/view/22311
