G6PD adalah kelainan genetik yang berhubungan dengan kromosom X yang diturunkan akibat mutasi gen G6PD. Defisiensi G6PD merupakan salah satu gangguan herediter yang paling sering dijumpai, dengan perkiraan 400 juta orang terkena dampaknya di seluruh dunia, terutama di daerah tropis termasuk daerah endemik malaria.
Penurunan aktivitas enzim G6PD dapat menimbulkan gejala klinis dari yang ringan hingga berat antara lain hemolisis akut dan kronis, hiperbilirubinemia pada neonatal, gejala neurologis hingga dapat menimbulkan kematian bila tidak dimonitordengan benar. Timbulnya anemia hemolitik dari yang ringan hingga berat dapat disebabkan oleh beberapa kondisi seperti terpapar bahan oksidan, memakan kacang fava, penyakit-penyakit infeksi dan dan obat–obatan tertentu seperti, Primaquin yang merupakan salah satu obat malaria dan beberapa jenis obat lain termasuk obat analgesik Paracetamol dan antibiotika Sulfamethoxasole.
Primakuin digunakan untuk pengobatan radikal malaria vivax dan untuk mencegah penyebaran malaria dengan cara membunuh gametosit pada malaria falciparum. Disisi lain Primakuin akan menyebabkan hemolitik pada seseorang dengan defisiensi G6PD. Dengan demikian akan menimbulkan masalah serius dalam upaya pengendalian dan pemberantasan malaria. Oleh karena itu perlu dilakukan pemeriksaan kadar enzim G6PD pada penderita malaria sebelum diberikan pengobatan.
Berbagai metode tes skrining G6PD telah banyak digunakan antara lain metode fluorescent, metode spektrofotometri, metode Formasan Ring (Fujii), metode Sephadex gel (Hirono). Untuk skrining pada masyarakat luas di lapangan, metode-metode tersebut sulit dilaksanakan karena berbagai kendala yaitu memerlukan aliran listrik, lampu ultra violet dengan ruangan gelap, memerlukan alat-alat laboratorium yang mahal seperti inkubator, reagen-reagen, disamping itu hasil pemeriksaan baru dapat diketahui setelah waktu inkubasi yang cukup lama yaitu 6-8jam.
Untuk itu pada tahun 2003 kami telah mengembangkan metode WST-8 sebagai tes skrining kadar enzym G6PD secara cepat dan sederhana yang sangat bermanfaat untuk deteksi G6PD di lapangan (on-site), karena tidak memerlukan aliran listrik dan peralatan mahal. Hasil dapat diketahui dalam waktu 20 menit dengan mengamati perubahan warna (orange) yang dapat dilihat langsung dengan mata telanjang (naked eyes). Peralatan yang diperlukan hanya berupa mikropipet 20 ul dan 1 ml, tubes 1,5 ml (gambar 1).
Tube 1, Darah normal tanpa substrat (Kontrol negatif)
Tube 2, Defisiensi G6PD pada pria hemizygous
Tube 3, Defisiensi G6PD pada wanita heterozygous
Tube 4, Darah normal (Kontrol positif)
Beberapa hipotesa mengatakan bahwa terdapat korelasi geografis antara endemisitas malaria dan defisiensi enzym G6PD. Maka pada field survey di daerah endemis malaria kami melakukan kombinasi diagnosa cepat malaria dengan pewarnaan Acridine Orange (AO) dan skrining G6PD defisiensi metode WST-8 on-site secara simultan, sehingga pengobatan malaria dapat diberikan secara cepat dan Primaquin dapat diberikan dengan aman jika mereka mempunyai kadar enzim G6PD yang normal.
Pada tahun 2019 kami melakukan pengembangan metode skrining enzym G6PD yang baru, sebagai inovasi dari metode WST-8 sebelumnya yaitu menggunakan kombinasi substrat formazan lain yaitu MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) dalam kombinasi dengan hidrogen carrier, 1–methoxy–5-methylphenazinium methyl sulfate (1–methoxy PMS). MTT formazan menimbulkan reaksi warna ungu yang dapat dilihat langsung dengan mata telanjang (naked eyes), sehingga dengan mudah dapat membedakan antara warna oranye samar yang dihasilkan oleh penderita defisiensi G6PD pada wanita heterozigot dengan warna oranye muda pada darah normal yang mengalami hemolisis pada metode WST-8. Oleh karena keduanya memiliki dasar warna yang senada.
Metode kombinasi MTT/1-methoxy PMS, merupakan pencampuran dari beberapa formula yang dimasukkan kedalam 1,5-ml tube (tipe transparan). Formula tersebut adalah 20 μl larutan substrat yang mengandung 50 mM G6P, 4 mM NADP dalam 400 mM Tris- HCl buffer dengan 100 mM MgCl2 pada pH 7,2 – 7,5 ditambahkan larutan 20 μl dari 5 mM MTT didalam H2O, ditambahkan larutan 20 μl dari 1 mM PMS 1-methoxy dalam H2O dan terakhir ditambahkan dengan air aquades sebanyak 740 μl. Kemudian tube yang telah berisi campuran beberapa formula di atas diteteskan 5 ul darah segar yang diambil melalui finger prick atau bisa juga memasukkan darah kering pada filter paper.
Supaya dapat tercampur secara homogen tube digoyangkan lembut sebanyak 3-4 kali, setelah itu tube didiamkan selama 20 menit pada suhu kamar. Reaksi yang ditimbulkan berupa perkembangan warna ungu yang dapat dilihat langsung dengan mata telanjang (gambar 2). Hasil secara kualitatif dapat diketahui dengan mengamati perubahan warna ungu yang merupakan indikator kadar enzim G6PD didalam darah. Metode MTT ini sangat bermanfaat untuk skrining cepat G6PD di lapangan (on-site), dapat diaplikasikan dimana saja dan kapan saja karena tidak memerlukan aliran listrik dan peralatan mahal.
Tube 1, Darah normal tanpa substrat (Kontrol negatif)
Tube 2, Defisiensi G6PD pada pria hemizygous
Tube 3, Defisiensi G6PD pada wanita heterozygous
Tube 4, Darah normal (Kontrol positif)
Mengingat program Pemerintah dalam pengobatan malaria saat ini adalah memberikan kombinasi obat yang salah satunya adalah Primakuin. Dengan ditemukannya metode kombinasi MTT/1-methoxy PMS maka skrining cepat defisiensi G6PD dapat dilakukan secara simulltan dengan pemeriksaan malaria, sehingga pengobatan dengan Primakuin dapat diberikan secara aman untuk penderita yang terinfeksi dengan P.vivax, P.ovale atau P.falciparum dengan gametosit jika mereka mempunyai kadar enzim G6PD yang normal.
Penulis: Indah S. Tantular
Artikel lengkapnya dapat dilihat melalui link berikut ini:
