Dalam kedokteran gigi regeneratif, terapi berbasis sel punca mesenkimal (MSCs) adalah pendekatan yang menjanjikan dan sangat menarik untuk meningkatkan regenerasi dalam jaringan yang terjejas. MSCs mensekresikan faktor pertumbuhan yang menguntungkan yang dapat membantu proses penyembuhan luka. MSCs telah dikenal untuk memiliki kemampuan diferensiasi potensial ke dalam garis turunan mesenchymal, dapat diperbarui sendiri dengan tingkat proliferasi yang terkontrol dengan baik dan stabilitas genom secara in vitro. MSCs mengekspresikan penanda diferensiasi osteogenik Runx-2, Osteonektin, dan ekspresi Osteopontin. MSCs juga ungkapkan ekspresi Aggrecan sebagai penanda diferensiasi khondrogenik yang membuktikan kemampuan multipoten dari MSCs. MSCs dapat diisolasi dari berbagai sumber jaringan; seperti dari sumsum tulang8, pulpa gigi permanen atau gigi sulung, gingiva, folikel rambut dan jaringan adiposa.
Salah satu sumber MSC yang menjanjikan adalah jaringan adiposa yang dapat dengan mudah diisolasi dengan prosedur invasif minimum dibandingkan dengan sumsum tulang. Human adipose derived mesenchymal stem cells (HADMSCs) menyediakan jumlah sel punca yang berlimpah yang berpotensi untuk terapi berbasis sel punca atau pendekatan rekayasa jaringan. Selain itu, HAMSCs cocok untuk penggunaan klinis atau penyelidikan studi eksperimental jika diperlukan MSC dalam jumlah yang melimpah.
Terlepas dari potensi dan banyak keuntungan yang dimiliki oleh HAMSC, investigasi lebih lanjut harus dilakukan dalam mempertahankan multipotensi dan proliferasi HAMSC, ketika HAMSC diberikan dalam jaringan yang terjejas. Di pusat jaringan yang terjejas, kondisi lingkungan mikro hipoksia (kekurangan oksigen) terdeteksi. Kondisi hipoksia ditemukan di lingkungan mikro MSCs yang menyatakan bahwa MSCs mungkin adaptif terhadap pembatasan oksigen. Aktivasi mekanisme intraseluler oleh kondisi hipoksia mungkin bertanggung jawab atas apoptosis sel atau kondisi adaptif.
Cobalt (II) Chloride (CoCl2) adalah agen kimia yang murah dan mudah diperoleh. CoCl2 juga dapat digunakan untuk menginduksi kondisi hipoksia. Ekspresi Hypoxia Inducible Factor-1a (HIF-a) dalam kultur sel yang mencerminkan kondisi hipoksia. Meskipun ada penelitian sebelumnya dalam penggunaan CoCl2 yang meniru kondisi hipoksia, biokompatibilitas CoCl2 dan efeknya pada kultur HAMSC juga harus diperiksa lebih lanjut. Untuk alasan itu, penelitian ini bertujuan untuk menguji pengaruh CoCl2 dalam persentase viabilitas dan ekspresi HIF-a yang diinduksi dari HAMSC secara in vitro.
Sitotoksisitas dilakukan dengan menggunakan pewarna tetrazolium MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide. Pada sub-kultur keempat 5.103, HAMSCs ditanam per sumuran (n = 6) dalam lempeng sumuran mikrotiter 96-sumuran dan dikultur bersama dengan CoCl2 di berbagai konsentrasi (200μM, 150μM, 100μM, 75μM, 50µM, 25µM) selama 24 jam. MTT diberikan per sumuran masing-masing kelompok kemudian dilanjutkan dengan 3 jam inkubasi. Dimetil sulfoksida ditambahkan untuk menghentikan proses reaksi. Kristal formazan diamati, dan persentase viabilitas sel dihitung. Pembaca lempenga mikro kultur, dilakukan otomatis pada panjang gelombang 595 nm (GloMax Explorer, Wisconsin, USA) digunakan untuk mendeteksi optical density (OD).
Pada sub-kultur keempat dari 104 HAMSCs ditanam di plat mikrotiter 24-sumuran (Iwaki, Asahi, Jepang) dan dikultivasi dengan atau tanpa 100 μM CoCl2 dan a-MEM kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi 24 jam, media sel dihilangkan dan HAMSCs di setiap sumuran (n = 4) dicuci dengan 1xPBS kemudian fiksasi dengan paraformaldehyde 4%. Untuk menguji (CoCl2) menginduksi hipoksia HIF-1a ekspresi dalam HAMSCs, penelitian ini menggunakan metode ICC dengan kit pelabelan antibodi FITC poliklonal secara in vitro (BD Biosciences, USA). Ekspresi positif HIF-1a dalam HAMSC diamati dengan menggunakan mikroskop fluoresensi (Olympus, Tokyo, Jepang) dengan perbesaran 100x.
Data yang diperoleh dalam penelitian ini digambarkan sebagai rata-rata dan standar deviasi (SD). Dalam penelitian ini, SPSS versi 20.0 (digunakan untuk menganalisis data secara statistik. Analisis Varians (ANOVA) dilakukan untuk membandingkan data antara kelompok (p <0,05).
Dalam studi ini, HAMSCs yang dikultur terkonfirmasi sebagai MSC. HAMSCs mengekspresikan CD73 dan C105 secara positif. Sebagai perbandingan, HAMSC tidak mengekspresikan CD45. Kristal formazan ditemukan setelah reaksi MTT pada setiap kelompok (lihat Gambar 2A). Makroskopik HAMSC setelah reaksi MTT pada lempeng 96-kultur yang menunjukkan warna violet merah. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam persentase viabilitas HAMsC antara kelompok dengan konsentrasi CoCl2 yang berbeda (p = 0,99; p> 0,05). Pemberian 100μM CoCl2 telah berhasil menginduksi kondisi hipoksia yang dikonfirmasi oleh HIF-1a ekspresi positif dalam HAMSCs secara in vitro.
CoCl2 adalah HMA biokompatibel yang dapat digunakan pada HAMSCs secara in vitro. Penelitian lebih lanjut masih diperlukan untuk mengungkap mekanisme HAMSC dengan penambahan CoCl2 untuk tujuan aplikasi di bidang kedokteran gigi regeneratif.
Penulis:
Alexander Patera Nugraha, drg., M.Imun
Informasi detail dari riset ini dapat dilihat pada tulisan kami di
http://www.sysrevpharm.org/fulltext/196-1591714616.pdf?1591851651
